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Une adaptation fidèle du célèbre roman écrit par Gaston Leroux dans lequel le jeune reporter, Joseph Rouletabille, mène sa première enquête. Le professeur Stangerson et sa fille Mathilde vivent au château du Glandier où ils poursuivent des recherches scientifiques. Une nuit, Mathilde échappe de justesse à une tentative d'assassinat dans sa chambre jaune, pourtant fermée de l'intérieur. Rouletabille et son ami Sainclair se rendent sur les lieux, ils vont, au terme d'une enquête périlleuse, élucider « Le mystère de la chambre jaune ».

Le Parfum de la dame en noir nous permet de retrouver le Rouletabille du Mystère de la chambre jaune, dont il est la suite directe. Robert Darzac épouse enfin la belle Mathilde et nos jeunes mariés partent en voyage de noces dans le sud de la France. Rouletabille reçoit alors un appel au secours de Mathilde. Elle se sent menacée et est certaine que l'infâme Ballmeyer est de retour. Accompagné de Sainclair, Rouletabille la rejoint pour lui venir en aide. Il devra replonger dans son passé pour mettre un terme aux agissements criminels du terrible assassin...